Assessment of the single and mixture ecotoxicity of pharmaceuticals of environmental concern using aquatic test organisms / Avaliação da ecotoxicidade individual e das misturas de fármacos de preocupação ambiental usando organismos-teste aquáticos

Pharmaceuticals are contaminants of emerging concern which have been a target of increasing attention by the scientific community. Pharmaceuticals presenting high consumption, incomplete metabolism and incomplete removal at wastewater treatment plants have been frequently detected in aquatic ecosystems worldwide. This is the case of the pharmaceuticals metformin (MET), bisoprolol (BIS), sotalol (SOT) and ranitidine (RAN). However, ecotoxicity data for these contaminants are scarce, especially regarding behavior effects and chronic toxicity. In addition, the knowledge regarding the joint toxicity of these pharmaceuticals on non-target organisms is still incipient, which makes their environment risk assessment uncertain. This study aimed to fill these knowledge gaps for these four pharmaceuticals, by carrying out toxicity tests using five test organisms from three trophic levels. Different endpoints were assessed in tests with Raphidocelis subcapitata (algae), Lemna minor (macrophyte), Daphnia similis (crustacean), Hydra attenuate (cnidarian) and Danio rerio (fish). The binary and quaternary mixture acute toxicity for these pharmaceuticals were assessed on D. similis and D. rerio embryo tests, respectively. This study also aimed to evaluate the predictive accuracy of the Concentration addition (CA) and the Independent action (IA) classic models. In addition, the nature of the possible toxicological interactions between the pharmaceuticals in binary mixtures were also evaluated, using the Combination Index-isobologram (CI) method. The modelling of the concentration-response curves and the associated statistical analyses were performed using the automated spreadsheet ToxCalcMix v.1.0 and the software OriginPro 2015. The software CompuSyn was used for performing the mixture analyses with the CI method. The experimental planning of the binary mixture tests was performed using the fractioned factorial design, in order to cover several possible ratio and level-dependent effects with a reduced number of test organisms. The results obtained in this study are shown in four articles. In article 1, we provided a critical review and discussed the misunderstandings, deficiencies and data gaps on the ecotoxicity data of pharmaceuticals and personal care products mixtures published in the literature. In the following articles, the results obtained from the single and mixture toxicity tests performed in this study were presented and discussed. The pharmaceuticals MET (article 2) and BIS (article 3) were classified as hazardous to the aquatic environment, in the acute toxicity category. However, an ecological risk is not expected for the pelagic freshwater species exposed to these two pharmaceuticals, based on the chronic data obtained. The results obtained from the mixture toxicity tests (article 4) showed that most of the observed toxicity effects from the binary mixtures were in the zone between the predicted effects by the CA and IA models. The CI model showed to be an useful tool to describe the possible toxicological interactions occurring between the pharmaceuticals in joint action. Even statistically significant non-effect concentrations of the pharmaceuticals added up to induce significant adverse effects in mixtures (something from nothing). It was concluded that ecological risk assessment based on single toxic effects can underestimate the real impact of environmental contaminants on aquatic ecosystems

A contaminação ambiental por fármacos tem sido alvo de crescente preocupação pela comunidade científica. Fármacos de elevado consumo, incompleto metabolismo e remoção incompleta em estações de tratamento de esgoto, como é o caso da metformina (MET), bisoprolol (BIS), sotalol (SOT) e ranitidina (RAN), têm sido frequentemente detectados em matrizes aquáticas do mundo todo. Apesar disso, dados ecotoxicológicos consistentes para esses contaminantes são escassos, principalmente com relação a efeitos comportamentais e oriundos de estudos crônicos. Além disso, o entendimento dos efeitos de suas ações combinadas em organismos não-alvo é ainda incipiente, o que gera incertezas na avaliação dos seus riscos ambientais. Esta pesquisa teve por objetivo preencher essas lacunas de conhecimentos para esses quatro fármacos, por meio da realização de testes com cinco diferentes organismos-teste de três diferentes níveis tróficos. Foram analisados diferentes parâmetros avaliativos em testes com os organismos aquáticos Raphidocelis subcapitata (alga), Lemna minor (macrófita), Daphnia similis (crustáceo), Hydra attenuata (cnidário) e Danio rerio (peixe). As toxicidades agudas das misturas binárias e quaternárias desses quatro fármacos também foram avaliadas em testes com D. similis e embriões de D. rerio, respectivamente. Este trabalho também teve por objetivo avaliar a acurácia preditiva dos modelos de adição de concentração (CA) e ação independente (IA) e analisar a natureza das possíveis interações toxicológicas entre os fármacos, em misturas binárias, usando o modelo do Índice de Combinação (CI). A modelagem das relações concentração-resposta e as análises estatísticas associadas foram realizadas empregando-se a planilha automatizada ToxCalcMix versão 1.0 e o software OriginPro 2015. O software CompuSyn foi utilizado para as análises envolvendo o CI. O planejamento experimental dos testes de misturas binárias foi realizado por meio do design fatorial fracionado, a fim de cobrir diversas possíveis interações em várias proporções e níveis de efeitos, com a redução do número de organismos-teste. Os resultados desta pesquisa estão apresentados em quatro artigos. No artigo 1, realizou-se uma revisão crítica com relação às lacunas de conhecimentos e deficiências identificadas a partir da análise da literatura sobre a ecotoxicologia de misturas de fármacos e de produtos de higiene pessoal. Nos artigos seguintes, foram apresentados e discutidos os resultados oriundos dos testes com os quatro fármacos avaliados neste estudo. Os fármacos MET (artigo 2) e BIS (artigo 3) foram classificados como perigosos para o ambiente aquático, na categoria de toxicidade aguda. Contudo, um risco ecológico não é esperado para as espécies pelágicas de água doce expostas a esses dois fármacos, com base nos dados de toxicidade crônica obtidos. Os resultados dos testes de misturas (artigo 4) permitiram concluir que a maior parte dos efeitos observados das misturas binárias estiveram na zona entre os efeitos preditos pelos modelos clássicos de CA e IA. O modelo do CI mostrou-se uma ferramenta útil para descrever a natureza das possíveis interações toxicológicas que ocorrem entre os fármacos em ações combinadas. Mesmo concentrações de nenhum efeito estatisticamente significativo dos fármacos causaram efeitos adversos significativos quando em misturas (something from nothing). Concluiu-se que avaliações de risco ecológicas baseadas em efeitos tóxicos individuais de contaminantes ambientais podem subestimar o real impacto desses compostos em ecossistemas aquáticos

Metal evaluation and ecotoxicological bioassays using Chironomus xanthus in sediments of triângulo mineiro watercourses / Avaliação de metais e bioensaios ecotoxicológicos utilizando Chironomus xanthus em sedimentos de cursos de água do triângulo mineiro

This study aimed to evaluate metal contamination in sediments of the Triângulo Mineiro watercourses and also analyze the toxicity of the sediments using Chironomus xanthus larvae, as test organisms. We collected sediments from three streams (P1, P2 and P3) and collected sediments in three points of the Uberabinha River (P4, P5 and P6). We analyzed Cu, Cr, Mn, Mg and Zn, and also performed acute and chronic toxicity tests. Acute tests were categorized into toxic (death > 50%), toxicity signs (10 < mortality < 50%) and non-toxic (mortality < 10), according to common protocols. In the chronic toxicity tests, the surviving larvae were stored for body size measurements. Of the five metals analyzed, all were found in the six sampling points, but only Cu and Zn were present at higher levels than the "Threshold Effect Level" (TEL). The sediments of the six sites have some level of toxicity and the mortality in the acute and chronic toxicity tests was 100%. No statistically significant differences, between treatment and the control were found in the larval growth. Based on the metal contamination and the toxicity bioassay results, we consider it important to monitor sediments and to evaluate changes in land use in the adjacent water courses. (AU)

Este estudo objetivou avaliar a contaminação de metais nos sedimentos de cursos de água do Triângulo Mineiro e também analisar a toxicidade desses sedimentos utilizando larvas de Chironomusxanthus como organismo teste. Foram coletados sedimentos de três riachos (P1, P2 e P3) e também em três pontos do rio Uberabinha (P4, P5 e P6). Foram analisados Cu, Cr, Mn, Mg e Zn, e também realizados testes de toxicidade aguda e crônica. As amostras submetidas aos testes agudos foram categorizadas como tóxicas (mortalidade > 50%), evidências de toxicidade (mortalidade entre 10% e 50%) e não tóxicas (mortalidade <10%). Nos testes de toxicidade crônica, as larvas sobreviventes foram armazenadas para medidas do tamanho corporal. Dos cinco metais analisados, todos foram encontrados nos seis pontos amostrais, mas apenas Cu e Zn estavam presentes em níveis mais altos que TEL - Threshold Effect Level. Os sedimentos dos seis locais apresentam toxicidade ou indício de toxicidade e a mortalidade nos testes de toxicidade aguda e crônica foi de 100%. Não foram encontradas diferenças estatisticamente significativas, entre o tratamento e o controle, no crescimento larval. Com base na contaminação verificada e nos resultados dos bioensaios de toxicidade, consideramos importante monitorar os sedimentos e as mudanças no uso dos solos adjacentes aos cursos de água. (AU)

Antimicrobial activity and acute and chronic toxicity of the essential oil of Lippia origanoides / Atividade antimicrobiana, toxicidade aguda e crônica do óleo essencial de Lippia origanoides

Currently, there is a growing interest in medicinal plants, because of an increased demand for alternate therapies. In this study, the antimicrobial activity and toxicity of the essential oil of Lippia origanoides (L. origanoides) were investigated. The essential oil of L. origanoides was extracted by steam-dragging distillation and its constituents were identified by chromatography coupled with mass spectrometry. Among the 15 compounds identified, the most abundant were carvacrol (29.00%), o-cymene (25.57%), and thymol methyl ether (11.50%). The essential oil was studied in antimicrobial assays to determine the MIC and MBC. The results indicated that a concentration of 120μL/mL of oil was sufficient to inhibit the growth of the following microorganisms: Escherichia coli (ATCC 25922), Staphylococcus aureus (ATCC 25923) and Salmonella cholerasuis (ATCC 10708). Acute and chronic toxic effects of orally administered oil were investigated in Wistar rats by using standard methods. Doses of 30, 60 and 120mg/kg of the essential oil did not induce significant changes in weight, behavior or hematological and biochemical parameters in the animals. There were no signs of any histopathological changes to the liver, kidneys or heart of the treated rats, suggesting that Lippia origanoides oil is non-toxic after oral administration in acute or chronic toxicity studies. The results obtained in this study show that the essential oil of L. origanoides has a high safety margin, with no detectable toxic effects in rats treated with doses to 120mg/kg. In addition, L. origanoides oil demonstrated potent antimicrobial activity against S. aureus, E. coli and S. cholerasuis. Based on these findings, this essential oil may have practical application as a veterinary antimicrobial.

Atualmente nota-se um aumento do interesse pelas plantas medicinais, fruto da grande procura por terapias alternativas. Neste trabalho foi avaliada a atividade antimicrobiana e a toxicidade do óleo essencial da Lippia origanoides (alecrim-pimenta). O óleo essencial de alecrim-pimenta foi obtido por arraste com vapor d’água e seus constituintes foram identificados por cromatografia acoplada a espectrofotômetro de massa (GC/MS). Entre os 15 compostos identificados os mais abundantes foram o carvacrol (29%), o-cimeno (25,57%) e metil timol éter (11,50%). Os óleos foram submetidos a ensaios antimicrobianos para determinação da CIM e da CBM. Os resultados mostraram que a dose de 120μl/mL de qualquer um dos óleos testados foi eficiente em inibir o crescimento dos micro-organismos Escherichia coli (ATCC 25922), Staphylococcus aureus (ATCC 25923) e Salmonella cholerasuis (ATTCC 10708). Os efeitos tóxicos agudos e crônicos foram verificados em animais segundo método de classes - Toxicidade aguda oral (dose fixas) - OECD 420. As concentrações de 30, 60 e 120 mg/kg de óleo essencial não induziram alterações significativas no peso, no comportamento dos animais e nem nos parâmetros hematológicos e bioquímicos. Também não houve presença de alterações histopatológicas no fígado, rins e coração sugerindo que o óleo de alecrim-pimenta é atóxico após administração oral em condições agudas ou crônicas. Os resultados obtidos neste trabalho levam a concluir que o óleo essencial de alecrim-pimenta possui uma margem elevada de segurança, com efeitos tóxicos inexistentes além de apresentar atividade antimicrobiana eficaz contra os micro-organimos S. aureus, E. coli e S. cholerasuis. Sua utilização na medicina veterinária deve ser considerada como uma grande viabilidade econômica e sustentável.

Biomarcadores histológicos: toxicidade crônica pelo Roundup em piauçu (Leporinus macrocephalus) / Histological biomarkers: chronic toxicity for roundup in piauçu (Leporinus macrocephalus)

Avaliou-se o uso de brânquias, fígado e rins como biomarcadores histológicos em ensaio de toxicidade crônica com o herbicida Roundup® em piauçu (Leporinus. macrocephalus). Para tanto, os animais foram expostos a 1,58mg/L, dose equivalente a 1/10 da CL50 para a espécie por 14 e 28 dias, sendo utilizados cinco animais por tratamento correspondentes aos dias 0, 14 e 28. Hemorragia e necrose hepática e congestão renal foram as alterações que apresentaram diferenças entre os animais expostos e os não expostos. Dentre os órgãos usados como biomarcadores histopatológicos, o fígado foi o que apresentou os melhores resultados, seguido pelo rim.

The use of gills, liver, and kidneys as histological biomarkers was evaluated in a chronic toxicity analysis with herbicide Roundup® in piauçu (Leporinus macrocephalus). The animals were exposed to 1/10 of LC50 (1.58mg/L), during a period of 14 and 28 days. Five animals were used for treatment (days 0, 14, and 28). Hepatic hemorrhage and necrosis and renal congestion were the alterations that presented differences between exposed and non-exposed animals. Among the organs used as histological biomarkers, the liver presented the best results, followed by the kidneys.

The influence of algal densities on the toxicity of chromium for Ceriodaphnia dubia Richard (Cladocera, Crustacea) / Influência de diferentes densidades algais sobre a toxicidade do cromo para Ceriodaphnia dubia Richard (Crustacea, Cladocera)

Food availability may affect metal toxicity for aquatic organisms. In the present study, the influence of high, medium and low densities of the algae Pseudokirchneriella subcapitata (10(6), 10(5) and 10(4) cells.mL-1, respectively) on the chronic toxicity of chromium to the cladoceran Ceriodaphnia dubia was investigated. C. dubia was exposed to a range of chromium concentration from 2.71 to 34.04 µg.L-1 and fed with algae at various densities. In another experiment, the green alga was exposed to chromium concentrations (94 to 774 µg.L-1) and supplied as food in different densities to zooplankton. The survival and reproduction of the cladoceran were measured in these toxicity tests. The IC50 for Cr to P. subcapitata and metal accumulated by algal cells were determined. The results of a bifactorial analysis (metal versus algal densities) showed that metal toxicity to zooplankton was dependent on algal densities. Significant toxic effects on the reproduction and survival of C. dubia were observed at 8.73, 18.22 and 34.04 µg.L-1 Cr when the test organisms were fed with 10(6) cells.mL-1 of P. subcapitata. Although the chlorophyta retain low chromium content, a decrease in the reproduction and survival of C. dubia occurred when they were fed with high algal density contaminated with 774 µg.L-1 Cr. It was concluded that high algal density have an appreciable influence on chromium toxicity to daphnids.

A disponibilidade de alimento pode afetar a toxicidade dos metais para os organismos aquáticos. No presente estudo, a influência de alta, média e baixa densidades da alga Pseudokirchneriella subcapitata (10(6), 10(5) e 10(4) céls.mL-1, respectivamente) sobre a toxicidade crônica do cromo para o cladócero Ceriodaphnia dubia foi investigada. C. dubia foi exposta a uma faixa de concentração de cromo de 2,71 a 34,04 µg.L-1 e alimentada com diferentes densidades algais. Em outro experimento, a alga foi exposta a concentrações de cromo (94 a 774 µg.L-1) e oferecida como alimento ao cladócero em diferentes densidades. A sobrevivência e a reprodução do cladócero foram medidas nesses testes de toxicidade. O valor da CI50 do cromo para P. subcapitata e a concentração de metal retido pelas células algais foram determinados. Os resultados da análise bifatorial (metal versus densidades algais) mostraram que a toxicidade do metal ao zooplâncton foi dependente da densidade algal. Efeitos tóxicos significativos na sobrevivência e reprodução de C. dubia foram observados a 8,73, 18,22 e 34,04 µg.L-1 Cr quando o organismo-teste foi alimentado com 10(6) céls.mL-1 de P. subcapitata. Apesar de a alga reter pouco cromo, decréscimo na sobrevivência e na reprodução de C. dubia ocorreu quando alimentada com alta densidade algal contaminada com 774 µg.L-1 Cr. Concluiu-se que alta densidade algal tem uma considerável influência na toxicidade do cromo aos dafinídeos.

The influence of algal densities on the toxicity of chromium for Ceriodaphnia dubia Richard (Cladocera, Crustacea)

Food availability may affect metal toxicity for aquatic organisms. In the present study, the influence of high, medium and low densities of the algae Pseudokirchneriella subcapitata (10(6), 10(5) and 10(4) cells.mL-1, respectively) on the chronic toxicity of chromium to the cladoceran Ceriodaphnia dubia was investigated. C. dubia was exposed to a range of chromium concentration from 2.71 to 34.04 µg.L-1 and fed with algae at various densities. In another experiment, the green alga was exposed to chromium concentrations (94 to 774 µg.L-1) and supplied as food in different densities to zooplankton. The survival and reproduction of the cladoceran were measured in these toxicity tests. The IC50 for Cr to P. subcapitata and metal accumulated by algal cells were determined. The results of a bifactorial analysis (metal versus algal densities) showed that metal toxicity to zooplankton was dependent on algal densities. Significant toxic effects on the reproduction and survival of C. dubia were observed at 8.73, 18.22 and 34.04 µg.L-1 Cr when the test organisms were fed with 10(6) cells.mL-1 of P. subcapitata. Although the chlorophyta retain low chromium content, a decrease in the reproduction and survival of C. dubia occurred when they were fed with high algal density contaminated with 774 µg.L-1 Cr. It was concluded that high algal density have an appreciable influence on chromium toxicity to daphnids.

A disponibilidade de alimento pode afetar a toxicidade dos metais para os organismos aquáticos. No presente estudo, a influência de alta, média e baixa densidades da alga Pseudokirchneriella subcapitata (10(6), 10(5) e 10(4) céls.mL-1, respectivamente) sobre a toxicidade crônica do cromo para o cladócero Ceriodaphnia dubia foi investigada. C. dubia foi exposta a uma faixa de concentração de cromo de 2,71 a 34,04 µg.L-1 e alimentada com diferentes densidades algais. Em outro experimento, a alga foi exposta a concentrações de cromo (94 a 774 µg.L-1) e oferecida como alimento ao cladócero em diferentes densidades. A sobrevivência e a reprodução do cladócero foram medidas nesses testes de toxicidade. O valor da CI50 do cromo para P. subcapitata e a concentração de metal retido pelas células algais foram determinados. Os resultados da análise bifatorial (metal versus densidades algais) mostraram que a toxicidade do metal ao zooplâncton foi dependente da densidade algal. Efeitos tóxicos significativos na sobrevivência e reprodução de C. dubia foram observados a 8,73, 18,22 e 34,04 µg.L-1 Cr quando o organismo-teste foi alimentado com 10(6) céls.mL-1 de P. subcapitata. Apesar de a alga reter pouco cromo, decréscimo na sobrevivência e na reprodução de C. dubia ocorreu quando alimentada com alta densidade algal contaminada com 774 µg.L-1 Cr. Concluiu-se que alta densidade algal tem uma considerável influência na toxicidade do cromo aos dafinídeos.